如何提高丹參種子的凈度及進行種子質(zhì)量評定
丹參為唇形科鼠尾草屬植物。又名紫丹參、紅根、血參、大紅袍等，藥用部分為干燥根和根莖。隨著丹參藥材需求量的增加，栽培面積也隨之增大。種子育苗移栽是丹參生產(chǎn)上最常用的方法，少數(shù)地區(qū)也用分根繁殖。丹參種子繁殖比分根繁殖簡便快，而且移栽苗成活率高、長勢整齊。但是，由于丹參花期長，受自然條件的影響大，造成種子成熟度不一致，出苗率低，在自然條件下丹參種子的萌發(fā)一般只有30% ~40%，且出苗不齊。丹參種子易霉爛、不耐貯藏，陰濕、高溫都使種子迅速劣變。目前中藥材種子生產(chǎn)還多為一家一戶小規(guī)模經(jīng)營，由于各地氣候差異和種子儲藏的條件和習(xí)慣不一致，使得種子質(zhì)量難以控制。本研究對丹參種子的凈度分析、質(zhì)量測定、真實性鑒定、水分測定方法，生活力的檢測方法進行了研究，為丹參種子質(zhì)量檢驗提供依據(jù)。
1 材料
于2004年6月間在丹參主產(chǎn)區(qū)收集人工栽培的丹參當(dāng)年產(chǎn)種子。編號分別為山東萊蕪(BB，BW，BL，ML)、平邑(LⅠ， LⅡ， SⅠ)、臨朐(SFⅡ，LQ)、曲阜(Q)。
2 方法
2.1 凈度分析
2.1.1 一份全試樣法
取LQ，Q， BL，ML， BB， BW6份丹參種子。采用“徒手減半法”從每份樣本中分取試驗樣本80 g左右。將試樣分離成干凈種子、其他植物種子和一般雜質(zhì)3種成分后分別稱重，以g表示，計算凈種子質(zhì)量百分率、其他種子質(zhì)量百分率、雜質(zhì)質(zhì)量百分率，在種子凈度檢驗臺上進行凈度分析。
2.1.2 丹參實粒種子的清選
丹參種子空殼和癟粒情況嚴重，而且從外觀不易區(qū)分，尋找一種分離出丹參空殼與實粒種子的簡便方法。選取BW，BB，LQ，LⅡ，SⅠ，SFⅡ6份種子，分別用以下方法進行處理：
水分離法：常溫下，將種子浸泡于水中24 h，取上層的種子，用解剖刀逐粒剖開，將空殼和實粒的種子分別計數(shù)。再取下層的種子，與上層種子同樣操作。每處理2次重復(fù)，重復(fù)100粒。
風(fēng)選法：取種子30~50 g，用種子吹風(fēng)儀，風(fēng)力由45逐漸上升到54，風(fēng)選3 min后，將種子分成實粒和空殼兩部分，取其中一部分，隨機選取2個重復(fù)，每重復(fù)100粒，用解剖刀逐粒剖開，將空殼和實粒種子分別計數(shù)，再用同樣方法測定另一部分種子。
離心法：將種子放入10mL離心管中，蒸餾水為介質(zhì)，平衡后，以2 400 r?mim-1離心10 min。取出上層和下層的種子，用解剖刀逐粒剖開，利用種子數(shù)粒儀將空殼和實粒的種子分別計數(shù)，每處理4次重復(fù)，重復(fù)100粒。 經(jīng)過各種方法篩選后的實粒種子，置于雙層濾紙培養(yǎng)內(nèi)，每皿50粒， 4次重復(fù)， 25℃， 12 h光照發(fā)芽，并觀察其發(fā)芽情況，選出最適方法。
2.2 質(zhì)量測定
本試驗中，采取了百粒測定法、千粒測定法來測定丹參種子質(zhì)量。百粒測定法選用的材料為“LQ”，“Q”，“BL”，“ML”，“BB”，“BW”6份丹參凈種子。千粒測定法選用的材料為“SⅠ”，“SFⅡ”，“BB”3份凈種子。
2.3 真實性鑒定
采用種子外觀形態(tài)法，隨機數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，逐粒觀察丹參種子形態(tài)特征并記錄。
2.4 水分測定
高恒溫烘干法：取“LⅠ”，“LQ”2份丹參凈種子。烘干4 h，最初2 h內(nèi)，每隔15 min取出鋁盒稱重，而后每隔30 min取出稱重，至恒重，取出迅速放入干燥器中冷卻至室溫，約30~40 min后稱重。
2.5 生活力測定
用丹參種子“LⅡ”，“Q”。采用溴麝香草酚蘭法(BTB法)、紅墨水染色法、四唑法以及紙上熒光法分別測定丹參種子的生活力，探討最佳方法。
3 結(jié)果與分析
3.1 凈度分析
3.1.1 不同方法清選丹參實粒種子
丹參種子由于成熟期長，采收后雖然外觀完整，但種子胚的發(fā)育不一致，許多為空粒，如果把這部分種子當(dāng)作完整種子，將影響種子質(zhì)量檢驗方法的進一步分析，故需進行實粒種子的分離。用水分離法、風(fēng)選法和離心法清選丹參種子后實粒種子占的比例分別為86.4%，98.9%，95.8%。以風(fēng)選法效果最佳。
將經(jīng)過3種方法分離出來的實粒種子進行發(fā)芽試驗，風(fēng)選后的種子發(fā)芽率最高可達76%，而離心法后種子的發(fā)芽率只有33%，雖然風(fēng)選法和離心法篩選實粒種子的效率均較高，但離心法篩出的種子發(fā)芽率明顯低于其他2種方法低，說明種子經(jīng)過離心后，種子受到傷害，發(fā)芽率顯著下降(表1)。故采用風(fēng)力篩選法來去除丹參空殼。
表1 不同方法篩取丹參實粒種子后的發(fā)芽率%
3.1.2 凈度分析
種子的增失差都<5%，檢驗結(jié)果有效(表2)。
表2 丹參種子凈度分析結(jié)果%
丹參種子的凈度較低，種子凈度都低于70%，空殼在雜質(zhì)中占有較大比例。由于丹參花期長，種子成熟度很不一致；開花時容易遇上雨期，引起種子受粉不良，種子發(fā)育不完全，空殼較多。在種子流入市場前沒有經(jīng)過初步的清潔處理，從而凈度較低，影響種子的整體質(zhì)量。
3.2 質(zhì)量測定
丹參種子千粒重較穩(wěn)定。“ML”千粒重最大，為1.99 g，“BB”千粒值最小，為1.81 g，各樣品各測定值之間變異系數(shù)均小于4.0，結(jié)果有效(表3)。
表3 百粒法丹參種子千粒重
用千粒法測定的3份丹參種子的千粒重結(jié)果表明，3份種子2個重復(fù)之間的差數(shù)都<5%，表明測定結(jié)果有效。
用千粒法和百粒法測定同一份丹參種子樣本千粒重的結(jié)果表明，兩者之間沒有顯著性差異，但與用千粒法的試驗過程相比，用百粒法測定丹參種子的千粒重過程相對簡單，所以丹參種子質(zhì)量的測定宜采用百粒法。
3.3 真實性鑒定
丹參種子外部形態(tài)特征：小堅果，三棱狀長卵形，長2.5~3.3 mm，寬1.3~2 mm，灰黑色或茶褐色，表面為黃灰色糠秕狀蠟質(zhì)層覆蓋，背面稍平，腹面隆起脊，圓鈍，近基部兩側(cè)收縮稍凹陷；果臍著生腹面縱脊下方，近圓形，邊緣隆起，密布灰白色蠟質(zhì)斑，中央有1條C形銀白色細線。
3.4 水分測定
用高恒溫烘干法，丹參種子在最初的30 min內(nèi)迅速失去水分，隨后失水緩慢；烘干2.5，3，3.5 h時，測得種子的含水量值趨于穩(wěn)定，故選擇適宜烘干時間為3h。
3.5 生活力測定
用溴麝香草酚藍法及紅墨水染色法測定種子生活力，結(jié)果重復(fù)性較差，不能反映種子的真實生活力。紙上熒光法測定種子生活力時，發(fā)芽法檢測出的種子平均發(fā)芽率為46%，而熒光法則為15%，誤差較大，故不能用于丹參種子的生活力測定。因此，采用四唑染色法測定丹參種子生活力。
3.5.1 預(yù)濕處理
丹參種子直接浸泡在水中吸水充分，不容易出現(xiàn)破裂和損傷。預(yù)濕2，4，6 h的種子還未充分吸脹，且種皮尚硬；預(yù)濕12h后，種子吸脹充分而不過度，切剖最容易。預(yù)濕18，24h的種子吸水有些過度，組織有些腐軟。故預(yù)濕方法選取為常溫下在蒸餾水中直接浸泡12h。
3.5.2 暴露種子組織的方法
完整剝?nèi)シN皮的染色情況很好，顏色均勻，但是在觀察時還需再將種子剖開露出胚，操作上費工、費時，故不宜采用。沿腹縫線縱切與從子葉末端橫切去2/5的種子染色不太均勻，且不易觀察，也不宜采用。而沿垂直腹縫線縱切去2/5的種子染色情況很好，顏色均勻，也方便觀察，所以最終采用此法。
3.5.3 溶液的濃度和染色時間
在0.5%的四唑溶液染色，4h內(nèi)完全染色的種子數(shù)隨著染色時間的增加而增加，此后染色的種子數(shù)目基本不變，且種子染色均勻、深淺適宜(表4)。用5%四唑溶液染色4 h已經(jīng)充分，且4~6 h內(nèi)顏色正常，7 h后顏色過深，不便觀察。故丹參種子生活力測定為0.5%四唑溶液染色4 h。
表4 不同染色時間下丹參種子染色結(jié)果
3.5.4 生活力鑒定標準
200粒丹參種子離體胚發(fā)芽試驗中，可以看到，完整的胚發(fā)芽，長成的幼苗也是完整的，有些完整胚即使是新鮮的，但也不能發(fā)芽；即使種子胚能生成完整的子葉，一旦根有缺損，也不能生長成正常幼苗；子葉破損面積達1/2以上的胚不能發(fā)芽；生成的正常幼苗中，子葉若有破損，均是端處或側(cè)邊破損等于或小于子葉總面積的1/3。
根據(jù)200粒丹參種子四唑染色數(shù)據(jù)，擬定出丹參種子生活力四唑染色的鑒定標準(表5)。有生活力種子類：胚全部染色；子葉遠胚根一端≤1/3不染色，其余部分完全染色；子葉側(cè)邊總面積≤1/3不染色，其余部分完全染色；無生活力種子類：胚完全不染色；子葉近胚根處不染色；胚根不染色；子葉不染色總面積>1/3；胚所染顏色異常，且組織軟腐。
表5 丹參種子離體胚發(fā)芽和四唑染色結(jié)果總計
4 討論
在種子檢驗中，種子質(zhì)量一般可概括為兩個方面，一是反應(yīng)品種品質(zhì)的純度和真實性；二是體現(xiàn)種子播種品質(zhì)的凈度、千粒重、發(fā)芽率、生活力、活力、健康度和水分含量等。盡管衡量種子質(zhì)量特性較多，最終目的是要測定種子的種用價值。我國從20世紀50年代至今，執(zhí)行的農(nóng)作物種子質(zhì)量標準中，以純度、凈度、發(fā)芽率和水分4項指標對種子質(zhì)量進行分級定級。但是隨著種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要，在發(fā)達國家種子質(zhì)量評價不再局限于傳統(tǒng)的4項指標，對種子健康度、種子活力和品種純度檢驗的要求也日益增多。
丹參種子外表皮上有1層果膠，遇水后迅速吸漲，果膠中的糖類等有機物溶解，在熒光下會出現(xiàn)光圈，所以，用熒光法測定丹參種子生活力時不能夠準確地分別出死種子與活種子。
山東為我國丹參的主產(chǎn)區(qū)，主要以種子育苗移栽的方式進行栽培，且為我國丹參種子的主要產(chǎn)地，近年來，陜西商洛也采用育苗移栽的方式進行栽培，而四川中江主要采用分根栽培的方式，因此，以山東產(chǎn)的丹參種子為試驗材料具有一定的代表性。
