食品中山梨酸、苯甲酸的測定方法
1主題內容與適用范圍
本標準規定了醬油、水果汁、果醬等食品中山梨酸、苯甲酸含量的測定方法。
本標準適用于醬油、水果汁、果醬等食品中山梨酸、苯甲酸含量的測定。
最低檢出濃度：氣相色譜法最低檢出量為1μg，用于色譜分析的樣品為1g時，最低檢出濃度為1mg/kg。
第一篇氣相色譜法(第一法)
2原理
樣品酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，用附氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀進行分離測定，與標準系列比較定量。
3試劑
3.1乙醚：不含過氧化物。
3.2石油醚：沸程30～60℃。
3.3鹽酸。
3.4無水硫酸鈉。
3.5鹽酸(1＋1)：取100mL鹽酸，加水稀釋至200mL。
3.6氯化鈉酸性溶液(40g/L)：于氯化鈉溶液(40g/L)中加少量鹽酸(1＋1)酸化。
3.7山梨酸、苯甲酸標準溶液：準確稱取山梨酸、苯甲酸各0.2000g，置于100mL容量瓶中，用石油醚—乙醚(3＋1)混合溶劑溶解后并稀釋至刻度。此溶液每毫升相當于2.0mg山梨酸或苯甲酸。
3.8山梨酸、苯甲酸標準使用液：吸取適量的山梨酸、苯甲酸標準溶液，以石油醚－乙醚(3＋1)混合溶劑稀釋至每毫升相當于50，100，150，200，250mg山梨酸或苯甲酸。
4儀器
氣相色譜儀：具有氫火焰離子化檢測器。
5分析步驟
5.1樣品提取
稱取2.50g事先混合均勻的樣品，置于25mL帶塞量筒中，加0.5mL鹽酸(1＋1)酸化，用15，10mL乙醚提取兩次，每次振搖1min，將上層乙醚提取液吸入另一個25mL帶塞量筒中。合并乙醚提取液。用3mL氯化鈉酸性溶液(40g/L)洗滌兩次，靜止15min，用滴管將乙醚層通過無水硫酸鈉濾入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混勻。準確吸取5mL乙醚提取液于5mL帶塞刻度試管中，置40℃水浴上揮干，加入2mL石油醚－乙醚(3＋1)混合溶劑溶解殘渣，備用。
5.2色譜參考條件
5.2.1色譜柱：玻璃柱，內徑3mm，長2m，內裝涂以5%(m/m)DEGS＋1%(m/m)H3PO4固定液的60～80目ChromosorbWAW。
5.2.2氣流速度：載氣為氮氣，50mL/min(氮氣和空氣、氫氣之比按各儀器型號不同選擇各自的最佳比例條件)。
5.2.3溫度：進樣口230℃；檢測器230℃；柱溫170℃。
5.3測定
進樣2μL標準系列中各濃度標準使用液于氣相色譜儀中，可測得不同濃度山梨酸、苯甲酸的峰高，以濃度為橫坐標，相應的峰高值為縱坐標，繪制標準曲線。
同時進樣2μL樣品溶液。測得峰高與標準曲線比較定量。
5.4計算
式中：X1——樣品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg；
m1——測定用樣品液中山梨酸或苯甲酸的質量，μg；
V1——加入石油醚－乙醚(3＋1)混合溶劑的體積，mL；
V2——測定時進樣的體積，μL；
m2——樣品的質量，g；
5——測定時吸取乙醚提取液的體積，mL；
25——樣品乙醚提取液的總體積，mL。
由測得苯甲酸的量乘以1.18，即為樣品中苯甲酸鈉的含量。
結果的表述：報告算術平均值的二位有效數。
5.5允許差
相對相差≤10%。
5.6其他
在色譜圖中山梨酸保留時間為2分53秒；苯甲酸保留時間為6分8秒。
（圖略）
第二篇高效液相色譜法(第二法)
6原理
樣品加溫除去二氧化碳和乙醇，調pH至近中性，過濾后進高效液相色譜儀，經反相色譜分離后，根據保留時間和峰面積進行定性和定量。
7試劑
方法中所用試劑，除另有規定外，均為分析純試劑，水為蒸餾水或同等純度水，溶液為水溶液。
7.1甲醇：經濾膜(0.5μm)過濾。
7.2稀氨水(1＋1)：氨水加水等體積混合。
7.3乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱取1.54g乙酸銨，加水至1000mL，溶解，經濾膜(0.45μm)過濾。
7.4碳酸氫鈉溶液(20g/L)：稱取2g碳酸氫鈉(優級純)，加水至100mL，振搖溶解。
7.5苯甲酸標準儲備溶液：準確稱取0.1000g苯甲酸，加碳酸氫鈉溶液(20g/L)5mL，加熱溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，苯甲酸含量為1mg/mL，作為儲備溶液。
7.6山梨酸標準儲備溶液：準確稱取0.1000g山梨酸，加碳酸氫鈉溶液(20g/L)5mL，加熱溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，山梨酸含量為1mg/mL，作為儲備溶液。
7.7苯甲酸、山梨酸標準混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸標準儲備溶液各10.0mL，放入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL。經濾膜(0.45μm)過濾(同時測定糖精鈉時可加GB/T5009.28中3.4糖精鈉標準儲備溶液)。
8儀器
高效液相色譜儀(帶紫外檢測器)。
9分析步驟
9.1樣品處理
9.1.1汽水：稱取5.00～10.0g樣品，放入小燒杯中，微溫攪拌除去二氧化碳，用氨水(1＋1)調pH約7。加水定容至10～20mL，經濾膜(0.45μm)過濾。
9.1.2果汁類：稱取5.00～10.0g樣品，用氨水(1＋1)調pH約7，加水定容至適當體積，離心沉淀，上清液經濾膜(0.45μm)過濾。
9.1.3配制酒類：稱取10.0g樣品，放入小燒杯中，水浴加熱除去乙醇，用氨水(1＋1)調pH約7，加水定容至適當體積，經濾膜(0.45μm)過濾。
9.2高效液相色譜參考條件
9.2.1色譜柱：YWG－C184.6mm×250mm10μm不銹鋼柱。
9.2.2流動相：甲醇：乙酸銨溶液(0.02m0l/L)(5：95)。
9.2.3流速：1mL/min。
9.2.4進樣量：10μL。
9.2.5檢測器：紫外檢測器，波長230μm，靈敏度0.2AUFS。
根據保留時間定性，外標峰面積法定量。
9.3計算
式中：X2——樣品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m3——進樣體積中苯甲酸或山梨酸的質量，mg；
V4——進樣體積，mL；
V3——樣品稀釋液總體積，mL；
m4——樣品質量，g。
結果的表述：報告算術平均值的二位有效數。
9.4允許差：相對相差≤10%。
9.5其他
同GB/T5009.28的5.6。
注：本方法可同時測定糖精鈉。
第三篇薄層色譜法(第三法)
10原理
樣品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。將樣品提取液濃縮，點于聚酰胺薄層板上，展開。顯色后，根據薄層板上苯甲酸、山梨酸的比移值，與標準比較定性，并可進行概略定量。
11試劑
11.1異丙醇。
11.2正丁醇。
11.3石油醚：沸程為30～60℃。
11.4乙醚：不含過氧化物。
11.5氨水。
11.6無水乙醇。
11.7聚酰胺粉：200目。
11.8鹽酸(1＋1)：取100mL鹽酸，加水稀釋至200mL。
11.9氯化鈉酸性溶液(40g/L)：于氯化鈉溶液(40g/L)中加少量鹽酸(1＋1)酸化。
11.10展開劑。
11.10.1正丁醇＋氨水＋無水乙醇(7＋1＋2)。
11.10.2異丙醇＋氨水＋無水乙醇(7＋1＋2)。
11.11山梨酸標準溶液：準確稱取0.2000g山梨酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，此溶液每毫升相當于2.0mg山梨酸。
11.12苯甲酸標準溶液：準確稱取0.2000g苯甲酸，用少量乙醇溶解后移入100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，此溶液每毫升相當于2.0mg苯甲酸。
11.13顯色劑：溴甲酚紫－乙醇(50%)溶液(0.4g/L)，用氫氧化鈉溶液(4g/L)調至pH＝8。
12儀器
12.1吹風機。
12.2層析缸。
12.3玻璃板：10cm×18cm。
12.4微量注射器：10μL，100μL。
12.5噴霧器。
13操作方法
13.1樣品提取
稱取2.50g事先混合均勻的樣品，置于25mL帶塞量筒中，加0.5mL鹽酸(1＋1)酸化，用15，10mL乙醚提取兩次，每次振搖1min，將上層醚提取液吸入另一個25mL帶塞量筒中，合并乙醚提取液。用3mL氯化鈉酸性溶液(40g/L)洗滌兩次，靜止15min，用滴管將乙醚層通過無水硫酸鈉濾入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混勻。吸取10.0mL乙醚提取液分兩次置于10mL帶塞離心管中，在約40℃的水浴上揮干，加入0.10mL乙醇溶解殘渣，備用。
13.2測定
13.2.1聚酰胺粉板的制備：稱取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加約7mL水，研磨3～5min，立即倒入涂布器內制成10cm×18cm、厚度0.3mm的薄層板兩塊，室溫干燥后，于80℃干燥1h，取出，置于干燥器中保存。
13.2.2點樣：在薄層板下端2cm的基線上，用微量注射器點1μL、2μL樣品液，同時各點1μL、2μL山梨酸、苯甲酸標準溶液。
13.2.3展開與顯色：將點樣后的薄層板放入預先盛有展開劑(11.10.1或11.10.2)的展開槽內，展開槽周圍貼有濾紙，待溶劑前沿上展至10cm，取出揮干，噴顯色劑，斑點成黃色，背景為藍色。樣品中所含山梨酸、苯甲酸的量與標準斑點比較定量(山梨酸、苯甲酸的比移值依次為0.82，0.73)。
13.3計算
式中：X3——樣品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
m5——測定用樣品液中苯甲酸或山梨酸的質量，mg；
V5——加入乙醇的體積，mL；
V6——測定時點樣的體積，mL；
m6——樣品質量，g；
10——測定時吸取乙醚提取液的體積，mL；
25——樣品乙醚提取液總體積，mL。
注：本方法還可以同時測定果醬、果汁中的糖精。
第四篇禁用防腐劑定性試驗(第四法)
14硼酸、硼砂
14.1試劑
14.1.1鹽酸(1＋1)：量取鹽酸100mL，加水稀釋至200mL。
14.1.2碳酸鈉溶液(40g/L)。
14.1.3氫氧化鈉溶液(4g/L)：稱取2g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至500mL。
14.1.4姜黃試紙：稱取20g姜黃粉末，用冷水浸漬4次，每次各100mL，除去水溶性物質后，殘渣在100℃干燥，加100mL乙醇，浸漬數日，過濾。取1cm×8cm濾紙條，浸入溶液中，取出，于空氣中干燥，貯于玻璃瓶中。
14.2分析步驟
14.2.1樣品處理
稱取3～5g固體樣品，加碳酸鈉溶液(40g/L)充分濕潤后，于小火上烘干、炭化后再置高溫爐中灰化。量取10～20mL液體樣品，加碳酸鈉溶液(40g/L)至呈堿性后，置水浴上蒸干、炭化后再置高溫爐中灰化。
14.2.2定性試驗
14.2.2.1姜黃試紙法：取一部分灰分，滴加少量水與鹽酸(1＋1)至微酸性，邊滴邊攪拌，使殘渣溶解，微溫后過濾。將姜黃試紙浸入濾液中，取出試紙置表面皿上，于60～70℃干燥，如有硼酸、硼砂存在時，試紙顯紅色或橙紅色，在其變色部分熏以氨即轉為綠黑色。
14.2.2.2焰色反應
取灰分置于坩堝中，加硫酸數滴及乙醇數滴，直接點火，硼酸或硼砂存在時，火焰呈綠色。
15水楊酸
15.1試劑
15.1.1三氯化鐵溶液(10g/L)。
15.1.2亞硝酸鉀溶液(100g/L)。
15.1.3乙酸(50%)。
15.1.4硫酸銅溶液(100g/L)。稱取10g硫酸銅(CuSO4?H2O)，加水溶解至100mL。
15.2分析步驟
15.2.1樣品提取
按GB/T5009.28中9.1操作，將乙醚提取液蒸干后，殘渣備用。
15.2.2定性試驗
15.2.2.1三氯化鐵法：殘渣加1～2滴三氯化鐵溶液(10g/L)，水楊酸存在時顯紫堇色。
15.2.2.2確證試驗：溶解殘渣于少量熱水中，冷后加4～5滴亞硝酸鉀溶液(100g/L)，4～5滴乙酸(50%)及1滴硫酸銅溶液(100g/L)，混勻，煮沸0.5h，放置片刻，水楊酸存在時呈血紅色(苯甲酸不顯色)。
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準第一法由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草；第二法由天津食品衛生監督檢驗所、遼寧省食品衛生監督檢驗所、武漢市衛生防疫站、浙江省衛生防疫站、四川省衛生防疫站負責起草；第三、四法由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋
