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0　引言

壇紫菜( Porphy ra ha itanensis) 屬暖溫帶性海藻, 在我國(guó)東南沿海均有分布, 是優(yōu)良海藻栽培品種之一. 但近年來(lái)壇紫菜種質(zhì)退化、品質(zhì)下降, 造成生長(zhǎng)期縮短、病害嚴(yán)重、產(chǎn)量降低. 因此, 選育高產(chǎn)、抗病、耐高溫的紫菜新品種已成為亟待解決的問(wèn)題. 藻膽蛋白和葉綠素含量是紫菜品質(zhì)選育方面的重要指標(biāo)之一. 藻膽蛋白是紅藻、藍(lán)藻和某些甲藻中的一類特有的光合作用天然色素, 可分為藻紅蛋白( PE) 、藻藍(lán)蛋白( PC) 、別藻藍(lán)蛋白(APC) 三大類. 藻膽蛋白具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值, 既可以作為天然色素用于食品、化妝品、染料等工業(yè), 也可以制成熒光試劑, 用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域. 葉綠素則是一類不穩(wěn)定的化合物, 葉綠素含量不僅與生長(zhǎng)速度有很大關(guān)系, 并且干紫菜中葉綠素含量的多少與感官測(cè)定紫菜優(yōu)劣最為一致. 細(xì)胞的葉綠素含量隨種類和類群而有所不同, 同時(shí)還受年齡、生長(zhǎng)率、光照和營(yíng)養(yǎng)條件的影響. 自20世紀(jì)中葉發(fā)現(xiàn)藻膽蛋白以來(lái), 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)藻膽蛋白的性質(zhì)和化學(xué)組成進(jìn)行了大量的研究, 而且對(duì)于海藻不同生長(zhǎng)階段藻膽蛋白的含量以及氮源、光照對(duì)藻膽蛋白含量的影響進(jìn)行了研究. 但是,不同色澤紫菜品質(zhì)的比較研究以及在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各測(cè)定條件對(duì)藻膽蛋白和葉綠素a測(cè)定結(jié)果的影響,報(bào)道甚少. 本實(shí)驗(yàn)旨在了解不同色澤壇紫菜在不同培養(yǎng)條件下的藻膽蛋白及其葉綠素a含量的差異,以及測(cè)定過(guò)程中各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響, 從而為壇紫菜優(yōu)良品種的選育提供品質(zhì)方面的指標(biāo).

1　材料與方法

1.1　材料

各種不同品系的壇紫菜由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院壇紫菜種質(zhì)改良及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室提供, 挑選藻體完整,顏色正常, 有光澤、彈性好的生長(zhǎng)盛期藻體.

1.2　不同色澤藻體的培養(yǎng)

從褐紅色、紫色、紅色、桔紅色、綠色5種不同色澤的藻體幼苗中挑選長(zhǎng)度為3～5 cm、完整健康的藻體進(jìn)行充氣培養(yǎng), 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度維持在(20 ±1) ℃, 并定期更換培養(yǎng)液. 待藻體生長(zhǎng)至長(zhǎng)度為40～80 cm時(shí), 陰干后冷凍收藏備用.

1.3　不同溫度條件藻體的培養(yǎng)

本溫度實(shí)驗(yàn)設(shè)定了26、27、28、29、30 ℃共5個(gè)高溫實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組(21 ℃) , 實(shí)驗(yàn)藻體包括品系Z - 17的F3、Z - 26的F3、Z - 61的F3、Z - 81的F3 4個(gè)不同品系. 挑選完整健康的實(shí)驗(yàn)藻體(3～5 cm) 放入錐形瓶中, 在不同溫度的光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng). 光周期為12 L∶12 D, 光強(qiáng)為1 200～1 400 lx. 培養(yǎng)期間每天觀察記錄葉狀體生長(zhǎng)狀況和潰爛程度, 搖動(dòng)培養(yǎng)液2次以使其混合均勻. 每組藻體培養(yǎng)10 d, 藻體陰干后冷凍收藏備用.

1.4　藻膽蛋白與葉綠素a含量的測(cè)定

藻膽蛋白的測(cè)定方法參照文獻(xiàn), 略有改動(dòng). 從冰箱中取出冷凍的藻體, 稱2～3 g, 用適量蒸餾水快速洗滌3遍, 平鋪在干凈干燥的紗布上約1～3層, 在風(fēng)扇前吹干或在空調(diào)室陰干, 放在粉碎器中, 間歇粉碎至粉末狀. 精確稱取0.010 g和0.030 g各1 份, 放在研磨管中, 加入適量的0.05 mol/L 磷酸鈉緩沖液浸泡約3 min, 研磨至充分, 倒入50 mL燒杯中, 用緩沖液沖洗研磨管3次以上, 燒杯中液體總體積約為20 mL, 蓋上鋁箔蓋子, 放入冰箱冷凍( - 20 ℃) , 然后室溫避光解凍,如此反復(fù)凍融6次, 將提取液用300目篩絹網(wǎng)過(guò)濾至50 mL離心管中, 濾液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min, 取上清液, 定容至50 mL, 搖勻后分別于565、615、650 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值.葉綠素a含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn), 略有改動(dòng). 粉碎冰凍藻體的處理方法與測(cè)定藻膽蛋白的一致, 然后精確稱取0.010 g和0.030 g各1份, 放在研磨管中, 加入適量的90 %的丙酮水溶液浸泡約3 min, 研磨至充分(研磨過(guò)程應(yīng)避免強(qiáng)光照射) , 倒入40 mL的棕色磨口瓶中, 用90 %的丙酮水溶液沖洗和研磨, 蓋上瓶蓋, 將棕色磨口瓶放在避光的地方室溫提取葉綠素24 h. 提取液用300目篩絹網(wǎng)過(guò)濾至50 mL離心管中, 濾液于4 ℃、10 000 r /min離心20 min, 取上清液, 測(cè)定其體積, 搖勻后分別于666、730 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值.或者直接用手持葉綠素計(jì)、SPAD502葉綠素含量測(cè)定儀來(lái)進(jìn)行測(cè)定。

1.5　陰干藻體烘干質(zhì)量的測(cè)定

稱取陰干藻體01100 g, 放入培養(yǎng)皿中于105 ℃烘干3 h, 溫度稍降后即稱其質(zhì)量(防止吸潮).

1.6　不同前處理?xiàng)l件藻膽蛋白與葉綠素a含量的測(cè)定

1) 研磨與粉碎. 在對(duì)實(shí)驗(yàn)藻體進(jìn)行處理時(shí), 一組進(jìn)行研磨, 另一組進(jìn)行粉碎, 其他實(shí)驗(yàn)條件均相同, 分別進(jìn)行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測(cè)定.

2) 黑暗與光照. 在藻膽蛋白和葉綠素a的提取過(guò)程中, 一組避光(黑暗) , 另一組在3000 lx光照條件下提取, 其他實(shí)驗(yàn)條件均相同, 分別進(jìn)行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測(cè)定.

3) 被測(cè)藻體的質(zhì)量. 被測(cè)藻體質(zhì)量分別為0.010、0.030、0.050 g. 其他實(shí)驗(yàn)條件均相同, 分別進(jìn)行藻膽蛋白與葉綠素a含量的測(cè)定.

4) 凍融次數(shù). 實(shí)驗(yàn)藻體研磨后, 一組不凍融, 放在4 ℃冰箱中提取; 一組凍融3次; 一組凍融6次. 其他實(shí)驗(yàn)條件均相同, 然后分別進(jìn)行藻膽蛋白含量的測(cè)定.

5) 研磨溫度. 在對(duì)實(shí)驗(yàn)藻體進(jìn)行研磨時(shí), 一組在室溫條件下研磨, 一組用4 ℃的冷水保持低溫條件研磨. 其他實(shí)驗(yàn)條件均相同, 然后分別進(jìn)行藻膽蛋白含量的測(cè)定.

1.7　數(shù)據(jù)的計(jì)算與處理

藻膽蛋白和葉綠素a含量的計(jì)算參照文獻(xiàn)的公式計(jì)算; 數(shù)據(jù)處理用SPSS1310的單因素方差分析(one2way anova) 和t2test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2　結(jié)果

2.1　不同色澤藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量的差異

如圖1、圖2所示, 不同色澤的壇紫菜藻膽蛋白和葉綠素a的含量差異較大. 在所進(jìn)行測(cè)定的5種不同色澤的壇紫菜中, 褐紅色型壇紫菜的藻膽蛋白和葉綠素a 的質(zhì)量比均為最高, 分別達(dá)到114.87 mg/g和8.83 mg/g; 紫色型的藻膽蛋白的質(zhì)量比高達(dá)108.05 mg/g, 但是葉綠素a的質(zhì)量比卻較低(4.64 mg/g) ; 桔紅色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a的質(zhì)量比均比較低, 分別為59.81 mg/g和4.58 mg/g; 綠色型的藻膽蛋白的質(zhì)量比最低(55.39 mg/g). 統(tǒng)計(jì)分析表明桔紅色和綠色藻膽蛋白的質(zhì)量比差異顯著( P < 0.05) , 其余色澤間差異極顯著( P < 0.01) .

2.2　不同培養(yǎng)溫度對(duì)藻體色素含量的影響

在不同溫度的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中, 隨著溫度升高藻體容易出現(xiàn)潰爛. 在28、29 ℃培養(yǎng)的藻體顏色明顯變淡, 生長(zhǎng)緩慢或者不生長(zhǎng). 在4個(gè)不同品系的溫度實(shí)驗(yàn)中, 除Z - 26的F3外, 對(duì)照組藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量均低于高溫培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的藻體. 除Z - 17的F3的27 ℃實(shí)驗(yàn)組外, 各高溫實(shí)驗(yàn)組藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量隨著溫度升高而增加.

2.3　不同前處理?xiàng)l件對(duì)藻膽蛋白和葉綠素a含量測(cè)定結(jié)果的影響

1) 研磨與粉碎. 經(jīng)過(guò)研磨藻體的藻膽蛋白和葉綠素a測(cè)定結(jié)果明顯高于經(jīng)過(guò)粉碎的. 經(jīng)過(guò)研磨,紫色型和桔色型藻體的總藻膽蛋白含量分別是經(jīng)過(guò)粉碎的3.8倍和2.4倍. 經(jīng)過(guò)研磨藻體的葉綠素a的質(zhì)量比測(cè)定結(jié)果分別是經(jīng)過(guò)粉碎的10.4倍和11.9倍.

2) 光照與黑暗. 采取避光措施的紫色型和桔色型藻體的藻膽蛋白的質(zhì)量比分別比在3 000 lx光照條件下提取的高24.9 %和26.6 %. 而光照對(duì)葉綠素a測(cè)定結(jié)果的影響更大. 在光照條件下提取的紫色型和桔色型藻體的葉綠素a的質(zhì)量比測(cè)定結(jié)果分別為0.48 mg/g和2.04 mg/g; 而在鋁箔包裹的棕色瓶中提取的藻體, 葉綠素a的質(zhì)量比分別達(dá)到4.82 mg/g和5.47 mg/g, 分別是光照下提取的10.0倍和2.7倍.

3) 被測(cè)藻體的質(zhì)量. 被測(cè)藻體的質(zhì)量對(duì)藻膽蛋白和葉綠素a的質(zhì)量比的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有明顯的影響.

4) 凍融次數(shù)與研磨溫度. 藻膽蛋白的含量隨著凍融次數(shù)的增加而略有增加, 研磨溫度對(duì)藻膽蛋白的測(cè)定結(jié)果影響較小.

3　討論

3.1　壇紫菜色素含量與生長(zhǎng)的關(guān)系

壇紫菜選育可以通過(guò)蛋白質(zhì)、藻膽蛋白以及葉綠素a含量、生長(zhǎng)速度、藻體厚度等重要指標(biāo)來(lái)確定其品種的優(yōu)劣. 藻膽蛋白是壇紫菜光合作用中重要的輔助色素蛋白, 其中藻紅蛋白在紅藻的捕光色素系統(tǒng)中首先捕獲光能, 然后傳遞給藻藍(lán)蛋白, 再傳遞給別藻藍(lán)蛋白; 藻膽蛋白還可以作為藻體細(xì)胞的貯存蛋白, 有利于藻類在自然界中的生存競(jìng)爭(zhēng). 壇紫菜在不同生長(zhǎng)期, 藻膽蛋白總量占干壇紫菜的百分含量由初期到盛期基本不變, 到末期大幅度減少. 藻膽蛋白在藻體細(xì)胞中直接參與光合作用中的能量吸收和傳遞. 葉綠素a是壇紫菜重要的光合色素, 含量的高低與藻體本身的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛與否密切相關(guān). 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同色澤的壇紫菜4種主要色素的差異顯著, 其中褐色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量較高, 相應(yīng)地該品系的藻體生長(zhǎng)較快; 而生長(zhǎng)相對(duì)較慢的桔紅色型藻體的藻膽蛋白和葉綠素a含量較低. 這充分證明了藻膽色素和葉綠素a作為紫菜光合作用的捕光色素, 與紫菜生長(zhǎng)的關(guān)系密切.

3.2　測(cè)定條件對(duì)壇紫菜色素含量測(cè)定結(jié)果影響的分析

藻膽蛋白屬于胞內(nèi)蛋白質(zhì), 要破碎海藻細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜, 才能使藻膽蛋白以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái), 并注意保持其活性. 細(xì)胞破碎程度越高, 藻膽蛋白的得率和純度也越高, 不同的細(xì)胞破碎方法提取效果不同. 因此, 采用何種細(xì)胞破碎技術(shù)是直接影響藻膽蛋白提取效率的關(guān)鍵因素之一.本實(shí)驗(yàn)以藻膽蛋白含量測(cè)定結(jié)果為指標(biāo), 對(duì)研磨法和反復(fù)凍融法的破壁效果進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示研磨法能破碎80 %以上的細(xì)胞, 若將研磨法和反復(fù)凍融法結(jié)合起來(lái), 先用研磨法破碎絕大多數(shù)的細(xì)胞,針對(duì)游離的細(xì)胞再用反復(fù)凍融法使其破碎, 能更加準(zhǔn)確地測(cè)定細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)含量. 藻膽蛋白在受熱或強(qiáng)光照射時(shí)易變性, 葉綠素受光照時(shí)容易氧化分解, 因此在提取過(guò)程中應(yīng)避免光照并保持低溫.

3.3　壇紫菜主要色素的應(yīng)用前景展望

壇紫菜作為一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的紅藻, 具有多種生物活性成分, 如紫菜的多糖具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血等功能; 紫菜的β - 胡蘿卜素能猝滅生物體內(nèi)化學(xué)活性很高的自由基, 從而降低因自由基誘發(fā)的過(guò)氧化作用, 具有延緩衰老和抵抗癌癥的作用. 而且壇紫菜除了其食用、藥用、營(yíng)養(yǎng)和提取活性物質(zhì)等價(jià)值外, 不同色澤的壇紫菜在發(fā)展觀賞業(yè)、提取色素和制成色澤鮮艷的食品等方面都具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值. 藻膽蛋白作為紫菜體內(nèi)的捕光色素蛋白和胞內(nèi)儲(chǔ)存蛋白, 同樣也具有重要的生理功能; 而葉綠素不僅與生長(zhǎng)速度有很大關(guān)系, 并且干紫菜中葉綠素含量的多少跟感官評(píng)定紫菜優(yōu)劣最為一致. 因此, 本研究能更加準(zhǔn)確地測(cè)定藻膽蛋白和葉綠素a含量, 為紫菜優(yōu)良品種的選育和應(yīng)用提供依據(jù). 本研究還初步探討了藻膽蛋白和葉綠素a含量與培養(yǎng)環(huán)境的關(guān)系, 但是, 對(duì)于環(huán)境因素所引起的細(xì)胞在微觀水平上的變化及生理機(jī)理, 還有待于進(jìn)一步的研究.