化學發光分析方法測量蛋白質含量的優勢及步驟
來源： http://www.yoshikomatsuura.com/ 類別：實用技術 更新時間：2013-03-07 閱讀次
【本資訊由中國糧油儀器網提供】 目前，蛋白質的測定方法有雙縮脲法、Lowry法、Bradford法、染料結合分光光度法、液相色譜法、毛細管電泳法、自動型凱氏定氮儀等。化學發光分析方法由于靈敏度高、分析速度快、裝置簡便的特點，在食品和環境監測、生物和醫學領域顯示出廣泛的應用前景。已有大量文獻報道了流動注射化學發光法用于金屬離子、氨基酸和藥物分析測定，也有一些用于蛋白質檢測方面的報道。本試驗發現某些蛋白質對魯米諾-鐵氰化鉀體系發光反應具有很強的增敏特性，并通過優化反應的各種條件，建立了一種測定蛋白質的分析方法。儀器與試劑自行組裝的流動注射化學發光儀，包括IFIS-C型智能流動注射進樣器和CL流通池；R-212型光電倍增管；ND-802型直流前置放大器；HW-2000色譜工作站；818型酸度計。魯米諾儲備溶液：2.0×10-2mol•L-1；鐵氰化鉀儲備液：0.05mol•L-1；氫氧化鈉溶液：1.0mol•L-1；卵清白蛋白(OVA)儲備溶液：0.5mg•mL-1；牛血清白蛋白(BSA)儲備溶液：0.5mg•mL-1；溴化十六烷基三甲基胺(CTMAB)標準溶液：1.0×10-2mol•L-1；十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液：5.0×10-2mol•L-1；溴化鉀溶液：2.5mol•L-1；聚乙二醇辛基苯基醚(OP)溶液：2.0×10-2mol•L-1；β-環糊精(β-CD)溶液：2.0×10-2mol•L-1；三氯甲烷、乙醇、甲醇和乙腈均為體積分數為20%的水溶液。試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。試驗方法分析流路見圖1，魯米諾、鐵氰化鉀溶液(A泵)及載流、試樣(B泵)分別由兩蠕動泵輸入。從進樣閥出來的試樣在流經反應器時與載流在一定程度上相混，兩相反應的產物在流經流通池時得到檢測，信號由光電倍增管(PMT)放大，然后輸出。
流速的選擇化學發光流動注射體系中，流速太慢會導致最大發光信號出現在進入流通池之前；流速太快會導致最大發光信號出現在進入流通池之后，都不能被光電倍增管完全檢測。選擇載流、試樣的流速為5.0mL•min-1，魯米諾與鐵氰化鉀的流速為4.0mL•min-1。魯米諾濃度的選擇在卵清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀和牛血清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀兩體系中，當魯米諾的濃度在2.0×10-6~8.0×10-5mol•L-1范圍，隨著濃度的增加，兩體系的相對發光強度也增大，但當魯米諾濃度超過5.0×10-5mol•L-1時，相對發光強度均降低。魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1時，峰形好，信噪比(S/N=3)最佳。選擇魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1。鐵氰化鉀濃度的選擇試驗結果表明：鐵氰化鉀濃度為6.0×10-4mol•L-1時相對發光強度達到最大；隨后鐵氰化鉀濃度繼續增大，蛋白質發光體系的相對發光強度反而降低。試劑pH值的選擇試驗結果表明：鐵氰化鉀與魯米諾的酸度對發光體系的相對發光強度都有明顯的影響，在pH為12.0和pH為12.2時，卵清白蛋白和牛血清白蛋白的發光強度和信噪比(S/N=3)達到最大。試樣pH值的選擇試驗結果表明：卵清白蛋白和牛血清白蛋白在pH9.0~12.2，pH9.0~12.5范圍內，體系的相對發光強度隨著試樣溶液的pH值升高而增大；隨后試樣的pH增大相對發光強度反而降低，而且噪音增大峰形變差。選擇試樣溶液的pH分別為12.2和12.5。增敏劑的選擇試驗結果表明：聚乙二醇辛基苯基醚的加入使反應的相對發光強度降低；溴化鉀和β-環糊精能明顯增強魯米諾-鐵氰化鉀體系相對發光強度，但對蛋白質-魯米諾-鐵氰化鉀無協同增強作用；十二烷基磺酸鈉、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未顯示出明顯的協同催化效果，溴化十六烷基三甲基胺對該體系的發光具有明顯增強作用。試驗選擇5.0×10-5mol•L-1溴化十六烷基三甲基胺溶液。化學發光曲線圖2為蛋白質標準樣品的化學發光曲線，試驗結果表明：蛋白質對魯米諾-鐵氰化鉀發光體系催化效應比較強；體系的反應迅速；化學發光體系有良好的穩定性和重現性。共存物質的影響在選定的試驗條件下，考察了多種物質對3.0×10-8mol•L-1牛血清白蛋白發光強度的影響，試驗結果表明：1000倍的甲醇、乙醇、EDTA、SO2-4、NO-3、F-；100倍的CHCl3、乙腈；50倍的亮氨酸；500倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、天冬酰胺、賴氨酸和谷氨酸；100倍的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+；1倍的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Cr6+；0.1倍的Ni2+、Co2+；大量的Na+、K+不干擾。Cr3+、OVA干擾嚴重。加入與金屬離子反應比例為1∶1的EDTA可以消除Mn2+以外的大部分金屬離子的干擾，加入100倍的EDTA后可完全消除金屬離子的干擾。線性范圍、檢出限與精密度在選定的試驗條件下，牛血清白蛋白和卵清白蛋白分別在1.5×10-10~3.8×10-7mol•L-1、1.8×10-10~2.2×10-7mol•L-1范圍內呈線性關系，回歸方程分別為I=3.0×109C+197.53(r=0.9988)和I=1.0×1010C+527.18(r=0.9964)；檢出限(S/N=3)分別為1.5×10-10mol•L-1、1.8×10-10mol•L-1；對7.6×10-8mol•L-1牛血清白蛋白標準樣品重復6次測定，相對標準偏差為0.88%。樣品測定結果按試驗方法對人體血清(用水稀釋1000倍)中的蛋白質總量進行測定。
本方法測定值Protein foundby thismethodρ/(g•L-1)RSD/%加標量Am′t ofstd. addedρ/(g•L-1)回收量Am′trecovered雙縮脲法測定值Protein foundby the Biuretmethodρ/(g•L-1)1 78.9 1.55 60.0 54.1 78.52 83.8 2.54 10.0 11.3 83.93 74.6 3.71 20.0 21.4 75.84 84.0 2.38 20.0 18.5 81.85 81.2 2.31 40.0 41.8 80.56 83.0 2.64 40.0 36.6 83.8本法測定蛋白質與經典的雙縮脲法相比，線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高，對人體血清樣品測定的結果表明，本法具有與雙縮脲法相當的準確度。
流速的選擇化學發光流動注射體系中，流速太慢會導致最大發光信號出現在進入流通池之前；流速太快會導致最大發光信號出現在進入流通池之后，都不能被光電倍增管完全檢測。選擇載流、試樣的流速為5.0mL•min-1，魯米諾與鐵氰化鉀的流速為4.0mL•min-1。魯米諾濃度的選擇在卵清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀和牛血清白蛋白-魯米諾-鐵氰化鉀兩體系中，當魯米諾的濃度在2.0×10-6~8.0×10-5mol•L-1范圍，隨著濃度的增加，兩體系的相對發光強度也增大，但當魯米諾濃度超過5.0×10-5mol•L-1時，相對發光強度均降低。魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1時，峰形好，信噪比(S/N=3)最佳。選擇魯米諾濃度為5.0×10-5mol•L-1。鐵氰化鉀濃度的選擇試驗結果表明：鐵氰化鉀濃度為6.0×10-4mol•L-1時相對發光強度達到最大；隨后鐵氰化鉀濃度繼續增大，蛋白質發光體系的相對發光強度反而降低。試劑pH值的選擇試驗結果表明：鐵氰化鉀與魯米諾的酸度對發光體系的相對發光強度都有明顯的影響，在pH為12.0和pH為12.2時，卵清白蛋白和牛血清白蛋白的發光強度和信噪比(S/N=3)達到最大。試樣pH值的選擇試驗結果表明：卵清白蛋白和牛血清白蛋白在pH9.0~12.2，pH9.0~12.5范圍內，體系的相對發光強度隨著試樣溶液的pH值升高而增大；隨后試樣的pH增大相對發光強度反而降低，而且噪音增大峰形變差。選擇試樣溶液的pH分別為12.2和12.5。增敏劑的選擇試驗結果表明：聚乙二醇辛基苯基醚的加入使反應的相對發光強度降低；溴化鉀和β-環糊精能明顯增強魯米諾-鐵氰化鉀體系相對發光強度，但對蛋白質-魯米諾-鐵氰化鉀無協同增強作用；十二烷基磺酸鈉、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未顯示出明顯的協同催化效果，溴化十六烷基三甲基胺對該體系的發光具有明顯增強作用。試驗選擇5.0×10-5mol•L-1溴化十六烷基三甲基胺溶液。化學發光曲線圖2為蛋白質標準樣品的化學發光曲線，試驗結果表明：蛋白質對魯米諾-鐵氰化鉀發光體系催化效應比較強；體系的反應迅速；化學發光體系有良好的穩定性和重現性。共存物質的影響在選定的試驗條件下，考察了多種物質對3.0×10-8mol•L-1牛血清白蛋白發光強度的影響，試驗結果表明：1000倍的甲醇、乙醇、EDTA、SO2-4、NO-3、F-；100倍的CHCl3、乙腈；50倍的亮氨酸；500倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、天冬酰胺、賴氨酸和谷氨酸；100倍的Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+；1倍的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Cr6+；0.1倍的Ni2+、Co2+；大量的Na+、K+不干擾。Cr3+、OVA干擾嚴重。加入與金屬離子反應比例為1∶1的EDTA可以消除Mn2+以外的大部分金屬離子的干擾，加入100倍的EDTA后可完全消除金屬離子的干擾。線性范圍、檢出限與精密度在選定的試驗條件下，牛血清白蛋白和卵清白蛋白分別在1.5×10-10~3.8×10-7mol•L-1、1.8×10-10~2.2×10-7mol•L-1范圍內呈線性關系，回歸方程分別為I=3.0×109C+197.53(r=0.9988)和I=1.0×1010C+527.18(r=0.9964)；檢出限(S/N=3)分別為1.5×10-10mol•L-1、1.8×10-10mol•L-1；對7.6×10-8mol•L-1牛血清白蛋白標準樣品重復6次測定，相對標準偏差為0.88%。樣品測定結果按試驗方法對人體血清(用水稀釋1000倍)中的蛋白質總量進行測定。
本方法測定值Protein foundby thismethodρ/(g•L-1)RSD/%加標量Am′t ofstd. addedρ/(g•L-1)回收量Am′trecovered雙縮脲法測定值Protein foundby the Biuretmethodρ/(g•L-1)1 78.9 1.55 60.0 54.1 78.52 83.8 2.54 10.0 11.3 83.93 74.6 3.71 20.0 21.4 75.84 84.0 2.38 20.0 18.5 81.85 81.2 2.31 40.0 41.8 80.56 83.0 2.64 40.0 36.6 83.8本法測定蛋白質與經典的雙縮脲法相比，線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高，對人體血清樣品測定的結果表明，本法具有與雙縮脲法相當的準確度。
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