利用葉綠素測量儀研究桑葉的葉綠素含量
葉綠素是植物吸收光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，它直接參與光能的吸收、傳遞、分配和轉(zhuǎn)化等過程，其含量的大小以及a/b的相對比值不僅可以反映植物的生長發(fā)育狀況、生理代謝水平及營養(yǎng)條件，還可作為環(huán)境生理研究的重要參考指標(biāo)[1]。因此，對其含量及a/b比值進(jìn)行測定與分析一直是植物生理學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。
葉綠素是脂溶性卟啉類化合物，在分子結(jié)構(gòu)上，葉綠素由脫鎂卟啉環(huán)、葉綠酸、葉綠醇、甲醇和二價(jià)鎂離子等部分構(gòu)成，各葉綠素結(jié)構(gòu)之間的差別很小，葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)Ⅱ上的附加基團(tuán)不同：前者是甲基，后者是甲醛基；在光學(xué)特性上，葉綠素a和b及其衍生物對紅光區(qū)(620~700 nm)和藍(lán)紫光區(qū)(400~500 nm)的光吸收特別強(qiáng)烈；而對綠光區(qū)(520~580 nm)的光則吸收較弱，因而葉綠素呈現(xiàn)綠色。
目前，葉綠素的提取方法主要有有機(jī)溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、吸附樹脂萃取法、超聲波萃取法和微波萃取法等。其中微波輔助萃取法和超臨界CO2萃取法由于能夠大大降低提取時(shí)間，并減少萃取溶劑的使用量，逐漸受到人們的關(guān)注，但超臨界CO2萃取法受操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、成本較高等因素的困擾，其應(yīng)用領(lǐng)域也受到限制。有機(jī)溶劑萃取法有直接利用葉綠素易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，選用合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，并輔助了微波、超聲波或離子交換分離等手段來提高效率和純度。因此，有機(jī)溶劑萃取法是最常用的葉綠素提取的常規(guī)方法。葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、葉綠素測量儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等，其中分光光度法具有準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，是葉綠素含量測定過程中應(yīng)用最為廣泛的方法。
筆者擬采用有機(jī)溶劑萃取法從桑葉中提取葉綠素，并利用分光光度法對葉綠素含量進(jìn)行測定，通過分析不同節(jié)位桑葉及桑葉不同部位的葉綠素含量，探討桑葉葉綠素的光譜特征及其含量的變化規(guī)律，以期為桑葉葉綠素的提取及含量測定提供方法性參考，并為桑葉葉綠素的進(jìn)一步研究提供參考數(shù)據(jù)。
1材料與方法：
1.1材料
1.1.1試驗(yàn)材料：桑葉，采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃。
1.1.2主要試劑：試驗(yàn)所用試劑均為分析純。
1.1.3主要儀器：UV-9100型紫外-可見分光光度計(jì)，由浙江托普分析儀器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，由杭州麥哲儀器設(shè)備廠生產(chǎn)；YP5001型電子天平，由浙江托普儀器廠生產(chǎn)；打孔器(d=0. 6 cm)。
1.2方法：
1.2.1葉綠素的提取含量測定方法。將采集到的新鮮桑葉帶回實(shí)驗(yàn)室洗凈、擦干后，用直徑為0.6 cm的打孔器打成小圓片；選取5片稱重，然后用6ml有機(jī)溶劑在暗室浸提24 h；于5 000 r/min離心機(jī)中離心5min，取上清液置于光徑為1.0 cm的比色皿中，用紫外-可見分光光度計(jì)測定其吸光值，并利用Arnon法的修正公式對其葉綠素含量進(jìn)行計(jì)算，分析桑葉葉綠素的光譜特征，進(jìn)而比較研究不同節(jié)位桑葉和桑葉不同部位葉綠素含量的變化規(guī)律，綠素含量用Arnon法的修正公式進(jìn)行計(jì)算：
其中，V為萃取溶劑體積(ml)；S為表面積(cm2)，通過樣品個(gè)數(shù)(5片)與打孔器面積(d=0.6 cm)之積進(jìn)行計(jì)算；Ca為葉綠素a含量，Cb為葉綠素b含量，Ca+b為葉綠素a和b的含量之和；A645、A663分別代表在波長為645 nm和663 nm下的吸光度值，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。
1.2.2 桑葉葉綠素光譜特征分析。用紫外-可見分光光度計(jì)在360~700 nm的波長范圍內(nèi)，測定不同波長條件下，桑葉葉綠素的吸光度值，繪制桑葉葉綠素的光譜圖。
2結(jié)果與分析：
2.1桑葉葉綠素的光譜特征：
通過測定不同波長條件下桑葉葉綠素的含量，繪制出其光譜圖(圖1)，由圖1可知：在試驗(yàn)范圍內(nèi)，桑葉葉綠素有2個(gè)強(qiáng)吸收帶，分別為400~460 nm和640~680 nm，其中400~460 nm為藍(lán)紫光區(qū)，吸收最高峰出現(xiàn)在432 nm處，而640~680 nm是紅光區(qū)，且在662 nm處出現(xiàn)最高吸收峰，這是由于葉綠素中的葉綠素a和葉綠素b分別在這2個(gè)波長處吸收最強(qiáng)，所得結(jié)果與其他高等植物葉片中葉綠素的吸收光譜圖基本一致。
2.2不同節(jié)位桑葉的葉綠素含量測定結(jié)果：
因所受光照強(qiáng)度不同、老嫩程度不一，不同節(jié)位桑葉的葉綠素含量也會(huì)有所不同。該研究采集第2、12和22節(jié)的桑葉(從底部到頂端依次排序)，用有機(jī)溶劑萃取法和分光光度法測定不同節(jié)位桑葉的葉綠素含量，并分析其變化規(guī)律，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，第12節(jié)桑葉中葉綠素含量最高，但葉綠素a/b的比值最低，為1.55；第2節(jié)桑葉中葉綠素含量稍低，葉綠素a/b比值為2.54；而第22節(jié)桑葉中葉綠素含量最少，但葉綠素a/b比值為2.46，與第2節(jié)桑葉的葉綠素a/b比值幾乎相等。
一般來說，上部葉片最嫩，中部次之，下部最老，且植物的氮素營養(yǎng)是從成熟葉片向幼嫩葉片轉(zhuǎn)運(yùn)，葉綠素含量成熟葉應(yīng)多于幼嫩葉。根據(jù)此理論，下部葉片中葉綠素含量應(yīng)最高，這與該研究結(jié)果有差異，之所以會(huì)出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，一方面可能是由于葉片所受光照強(qiáng)度不同引起的。中部葉片所受光照較下部葉片強(qiáng)烈，且從葉綠素a/b的比值也可以看出，中部葉片的葉綠素a/b最低，即葉綠素b的含量最高，說明桑樹中部葉片最耐陰，較低的光強(qiáng)即可刺激葉片進(jìn)行強(qiáng)烈的光合作用，這也是桑樹進(jìn)行光合作用的主要來源。上部葉片最嫩，雖然接受光強(qiáng)最強(qiáng)，但由于植物本身的生理特征決定了上部葉片的葉綠素含量最低。另一方面可能是由試驗(yàn)誤差引起的差異。從試驗(yàn)結(jié)果可知，中部葉片葉綠素含量的測定結(jié)果的誤差最大，引起該誤差的因素有很多，這也是造成結(jié)果不一的1個(gè)因素。
2.3 桑葉不同部位的葉綠素含量測定結(jié)果：
一片桑葉因不同的光照強(qiáng)度、營養(yǎng)狀況及生理?xiàng)l件間的細(xì)微差別，會(huì)導(dǎo)致桑葉不同部位中葉綠素含量也有差異。該研究將桑葉分為3部分，即葉尖、葉中和葉柄，分別測定不同部位的葉綠素含量，結(jié)果如圖3所示。
由圖3可知，靠近葉柄處葉綠素含量明顯高于其他部位，葉綠素含量高低順序?yàn)槿~柄處(葉中部(葉尖部，呈現(xiàn)出下部葉位大于上部葉位的規(guī)律。這可能是因?yàn)橹参锏牡貭I養(yǎng)是從成熟葉片向幼嫩葉片轉(zhuǎn)運(yùn)，葉綠素含量成熟葉多于幼嫩葉，使桑樹葉片葉色隨之發(fā)生相應(yīng)變化而導(dǎo)致吸光值的不同。此外，葉尖部的葉綠素a/b比值最低，葉柄處的最高，葉中部其次，說明桑葉葉尖部最耐陰，葉綠素b含量較高，可適應(yīng)陰生生境，而葉柄部相對最不耐陰。
3結(jié)論與討論：
對葉綠素進(jìn)行準(zhǔn)確測定是植物生理學(xué)的重點(diǎn)研究內(nèi)容，葉綠素a和b含量的多少直接影響光合速率的大小，葉綠素a/b值也能反映一定的光合速率， a/b值高，光合活性也高，光合活性高，植物就具有較高的光合速率。試驗(yàn)結(jié)果表明：
①桑葉葉綠素光譜特征與其他高等植物葉綠素的光譜特征類似，可采用Arnon法的修正公式對葉綠素含量進(jìn)行計(jì)算。
②中間節(jié)位的桑葉中葉綠素含量最高，但其葉綠素a/b的比值卻最小，雖然該結(jié)果存在一定爭議，但從葉綠素含量來看，桑樹光合作用的葉綠素主要來源是中部節(jié)位的葉片。
③對同一片葉子而言，因光照強(qiáng)度、營養(yǎng)狀況和生理?xiàng)l件的不同，不同部位葉片的葉綠素含量會(huì)有所不同，該研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，葉柄處的葉綠素含量最高， a/b值也最高，說明在葉柄處的光合速率最高，且由于葉綠素b的含量較低，說明葉柄處較適應(yīng)陽性生境，而葉尖處與其正好相反。
試驗(yàn)僅對桑葉中葉綠素的光譜特征及其含量的變化規(guī)律進(jìn)行了初步探討，該結(jié)果為葉綠素的進(jìn)一步研究提供了必要的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。
