利用消化爐和定氮儀對稻米中蛋白質(zhì)進行研究
蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，細胞和生物體在完成由基因編碼的生命活動過程中需要許多不同的蛋白質(zhì)協(xié)同作用，蛋白質(zhì)是細胞做功的工具，與生命的起源和進化都密切相關(guān)。所以食品中蛋白質(zhì)的多少，不僅表示食品的質(zhì)量，也關(guān)系著人體健康。食品中蛋白質(zhì)含量高低是評價食物營養(yǎng)成份的主要指標之一。稻米是人類重要的糧食作物，稻米蛋白質(zhì)因其為合理的蛋白及氨基酸組成而表現(xiàn)出優(yōu)良的營養(yǎng)品質(zhì)，蛋白質(zhì)含量不僅影響其營養(yǎng)品質(zhì)，而且也對蒸煮品質(zhì)有重要影響。在評價稻米品質(zhì)的相標準中蛋白質(zhì)及其含量被認為是評價品質(zhì)并為深加工行業(yè)生產(chǎn)提供工藝參數(shù)的重要指標之一。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，常見的有定氮儀法、紫外吸收法、雙縮脲法、消化爐法和質(zhì)譜法等。
有報道紫外吸收法無法測出牛奶、酸奶的蛋白含量，測出的豆?jié){蛋白含量也與實際值相差較大，不具實際使用價值。雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測定蛋白質(zhì)的方法，準確度好，精密度好，呈色穩(wěn)定性好，試劑單一，方法簡便，但靈敏度不高，約為1mg，故現(xiàn)在已很少使用。考馬斯亮藍染色法快速、靈敏，但只有作微量蛋白測定時的結(jié)果才準確，因此在實驗前將樣品稀釋至蛋白濃度為0. 1-1mg/mL，而且實驗必須在1h內(nèi)完成，不然測試結(jié)果不準確。
質(zhì)譜分析法中肽和蛋白的質(zhì)譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點，但是質(zhì)譜的準確性對測定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測定。測定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法，它是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標準檢驗方法。
凱氏定氮儀法適用樣品范圍廣泛、測試結(jié)果準確、重現(xiàn)性好，但是傳統(tǒng)的凱氏定氮法多利用開氏瓶消化和半微量定氮蒸餾器定氮，裝置復(fù)雜，蒸餾過程較難控制，易發(fā)生倒吸現(xiàn)象而致實驗失敗，并且消化時間長，對環(huán)境污染較大，不利于實際使用。
本實驗中使用定氮消化爐和自動定氮儀代替前兩者，既兼顧凱氏定氮法的準確性，操作又非常方便，節(jié)省時間，提高了工作效率，可適合大批量樣品測定。本實驗測定本地7種稻米中的蛋白質(zhì)含量，并對測試結(jié)果作比較分析，為人們食用稻米提供參考。
1實驗部分：
1.1實驗材料
巢湖市半湯鎮(zhèn)糧店購買的絲苗米、汕優(yōu)米、東北大米、當?shù)鼐久住⑴疵滓约皬膹]江縣白山鎮(zhèn)帶回的當?shù)氐脑绲久缀屯淼久坠?種樣品。
1.2主要儀器和試劑：
自動定氮儀（浙江托普儀器有限公司），梯度液晶消化爐（浙江托普分析儀器有限公司），電子分析天平，25 mL酸式滴定管。混合催化劑：硫酸鉀（K2SO4）100g，硫酸銅（CuSO4?5H2O）10g及硒（Se）1g，分別研磨成粉，再混合均勻。濃硫酸[H2SO4，ρ=1.84g/cm3，化學(xué)純]。硫酸標準液[c（1/2H2SO4）=0.02 mol/L]：先配制[c （1/2H2SO4）=0.1 mol/L]硫酸溶液，標定后稀釋5倍。氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=10mol/L]：400g氫氧化鈉放入1L的燒杯中，加入600mL的無CO2蒸餾水溶解，冷卻后，用無CO2的蒸餾水配成1L，充分混勻，儲于塑料瓶中。混合指示劑：溶解0.099g的溴甲酚綠和0.066g甲基紅于100mL的乙醇[w(CH3CH2OH)=95%]中。硼酸指示劑溶液[ρ（H3BO3）=20g/L]：溶解0硼酸于950mL的熱蒸餾水中，冷卻后，加入20mL的混合指示劑，充分混勻后，小心滴加氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=0.1mol/L]，直至溶液呈紅紫色（pH約4.5），稀釋成1L。
1.3實驗方法：
稱取烘干、磨碎（0.25mm）米粉0.2000g-0.4000g，置于50mL消煮管中，加混合催化劑1.8g，滴加幾滴蒸餾水濕潤樣品，再加入濃硫酸5mL，小心搖勻后蓋上小漏斗，置消化爐上消煮至溶液清亮帶藍綠色時，再加熱30分鐘后關(guān)上消化爐冷卻。將自動定氮儀上的蒸餾水、氫氧化鈉溶液、硼酸指示劑溶液、稀釋液、冷卻水、集液瓶連接好，打開儀器開關(guān)，將盛有消化液的消化管直接上機定氮。結(jié)束后用硫酸標準液滴定所得樣品。每批樣品測定同時按同樣操作步驟進行空白實驗，以校正試劑誤差。同時使用傳統(tǒng)的凱氏定氮法測定樣品，兩者結(jié)果進行比較。
1.4統(tǒng)計方法：
每個樣品分別做3個平行樣，取其均數(shù)加減標準差，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
2結(jié)果與討論：
2.1樣品的用量
稱樣量的大小取決于樣品的含氮量，若含氮1%-5%，稱樣量為0.2000g-0.4000g，可根據(jù)含氮量的水平適當增減稱樣量。
2.2樣品消化中注意事項：
樣品加入消化管時注意避免樣品黏附在管壁上防止消化不充分；緩慢調(diào)節(jié)消化爐上升溫度，避免溫度上升過快使消化管中消化液沖出，造成污染和結(jié)果不準確；樣品消化澄清后，應(yīng)繼續(xù)消化30分鐘，使樣品消化更完全，結(jié)果更為準確。
2.3消化定氮裝置
采用智能數(shù)控消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)開氏瓶，操作方面，可同時消化多個樣品，適合批量測樣。自動定氮儀不用人工加酸、加堿等繁瑣操作，使用方便，但要注意蒸餾、加酸、加堿、稀釋的時間控制和加熱功率選擇，盡量定氮完全。定氮儀在蒸餾過程中停冷卻水，缺液、安全門未關(guān)、樣品位置未放好、集收液溫度超溫等意外情況儀器提示或報警，安全高效。
2.4測定條件選擇
自動定氮儀采用單片微機控制，大屏幕液晶屏顯示，接通電源后按提示操作，簡單方便，控制可靠。樣品參數(shù)設(shè)置中，蒸餾時間為00.0-99.0分鐘，加酸時間為00.0-30.0秒，稀釋時間00.0-30.0秒，加堿時間00.0-30.0秒，蒸餾有四種模式，即功率為50%，60%，80%和100%。以上參數(shù)可根據(jù)實際情況靈活選擇，可自由調(diào)整。本次實驗中參數(shù)選擇為：蒸餾時間為07.0分鐘，加酸時間為05.0秒，稀釋時間05.0秒，加堿時間05.0秒，蒸餾功率為80%。
2.5粗蛋白質(zhì)凱氏定氮法測定的氮中還包含有氨基酸、酰氨等非蛋白質(zhì)氮，由此計算出的蛋白質(zhì)稱為“粗蛋白質(zhì)”，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離后進行全氮測定，由氮換算的蛋白質(zhì)含量稱為“純蛋白質(zhì)”。
2.6測試結(jié)果分析表1可見同一樣品的三次測定結(jié)果差異很小，表明自動定氮儀法測定結(jié)果很準確，重現(xiàn)性非常好。自動定氮儀法與傳統(tǒng)凱氏法對同一樣品測定結(jié)果基本一致（表2）。
不同稻米蛋白質(zhì)含量差異較大（表2），絲苗米、汕優(yōu)米和當?shù)鼐镜久椎鞍踪|(zhì)含量最大，三者之間沒有顯著差異；晚稻稻米蛋白質(zhì)含量較前三者低，比東北大米稍高；早稻米和糯米蛋白質(zhì)含量最低，且兩者沒有顯著性差異。
